Pregabalina nie jest GABAA ani agonistą receptora GABAB.
Pregabalina jest gabapentynoidem i działa poprzez hamowanie niektórych kanałów wapniowych. W szczególności jest ligandem pomocniczego miejsca podjednostki α2δ niektórych zależnych od napięcia kanałów wapniowych (VDCC), a zatem działa jako inhibitor VDCC zawierających podjednostkę α2δ. Istnieją dwie podjednostki α2δ wiążące lek, α2δ-1 i α2δ-2, a pregabalina wykazuje podobne powinowactwo do tych dwóch miejsc (a tym samym brak selektywności między nimi). Pregabalina wiąże się selektywnie z podjednostką α2δ VDCC. Pomimo tego, że pregabalina jest analogiem GABA, nie wiąże się z receptorami GABA, nie przekształca się in vivo w GABA ani innego agonistę receptora GABA oraz nie moduluje bezpośrednio transportu ani metabolizmu GABA. Jednakże stwierdzono, że pregabalina powoduje zależny od dawki wzrost ekspresji w mózgu dekarboksylazy kwasu L-glutaminowego (GAD), enzymu odpowiedzialnego za syntezę GABA, a zatem może mieć pewne pośrednie działanie GABAergiczne poprzez zwiększenie poziomu GABA w mózgu. Obecnie nie ma dowodów na to, że w działaniu pregabaliny pośredniczy jakikolwiek mechanizm inny niż hamowanie VDCC zawierających α2δ. Zgodnie z tym, hamowanie VDCC zawierających α2δ-1 przez pregabalinę wydaje się być odpowiedzialne za jej działanie przeciwdrgawkowe, przeciwbólowe i przeciwlękowe.
Endogenne α-aminokwasy L-leucyna i L-izoleucyna, które strukturą chemiczną bardzo przypominają pregabalinę i inne gabapentynoidy, są pozornymi ligandami podjednostki α2δ VDCC z podobnym powinowactwem jak gabapentynoidy (np. IC50 = 71 nM dla L- izoleucyna) i są obecne w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym w stężeniach mikromolowych (np. 12,9 µM dla L-leucyny, 4,8 µM dla L-izoleucyny). Wysunięto teorię, że mogą one być endogennymi ligandami podjednostki i mogą konkurencyjnie antagonizować działanie gabapentynoidów. Zgodnie z tym, chociaż gabapentynoidy, takie jak pregabalina i gabapentyna, mają nanomolowe powinowactwo do podjednostki α2δ, ich siła działania in vivo mieści się w niskim zakresie mikromolowym i uważa się, że za tę rozbieżność prawdopodobnie odpowiada konkurencja o wiązanie przez endogenne L-aminokwasy.

W jednym badaniu stwierdzono, że pregabalina ma 6-krotnie większe powinowactwo niż gabapentyna do VDCC zawierających podjednostkę α2δ. Jednakże inne badanie wykazało, że pregabalina i gabapentyna mają podobne powinowactwo do ludzkiej rekombinowanej podjednostki α2δ-1 (odpowiednio Ki = 32 nM i 40 nM). W każdym razie pregabalina jest 2 do 4 razy silniejsza jako lek przeciwbólowy niż gabapentyna, a u zwierząt wydaje się być 3 do 10 razy silniejsza jako lek przeciwdrgawkowy niż gabapentyna.